人けのない聖堂に脱獄犯アンジェロッティが入ってきて姿を隠す。やがて画家のカヴァラドッシが壁にマリア像を描く仕事に戻ってくる。肖像のモデルはアッタヴァンティ侯爵夫人だが、カヴァラドッシの恋人は歌姫トスカ。アンジェロッティが再び姿を見せると、旧知の二人は再会を喜ぶ。その時、トスカの声が聞こえ、アンジェロッティは再び隠れる。現れたトスカは、誰かがいた空気に、嫉妬の鎌首をもたげ、壁のマリア像を見て、アッタヴァンティ侯爵夫人に違いないと疑う。トスカは信心深く、聴罪師に話してしまうので、アンジェロッティがいることは打ち明けられない。優しく慰められてトスカは出ていく。郊外の隠れ家を教えていると、脱獄を知らせる砲声が鳴って二人は慌てて退場。入れ違いに聖堂の番人が皆を集めてナポレオン軍の敗退を知らせる。そこに悪名高い警視総監スカルピアが登場。脱獄犯の痕跡を見つけたスカルピアは、マリア像を描いているのがトスカの恋人と知って奸計をめぐらす。折悪しくトスカが戻ってくる。以前からトスカを我がものにと企んでいたスカルピアは、現場に残された侯爵夫人の扇を見せて嫉妬心を煽り、逆上して出て行くトスカを尾けるよう部下に命じる。聖堂内で枢機卿の行列が始まり、荘厳な「テ・デウム」の合唱を背景に、スカルピアは邪悪な心のうちを吐露する。

　スカルピアが己の欲望を満たすべく策をめぐらしているところへ、カヴァラドッシが連行されてくる。折しも王妃の広間で戦勝祝賀カンタータがはじまり、トスカの歌声も聴こえてくる。カヴァラドッシは脱獄犯の行方について口を閉ざしたまま。そこでスカルピアは演奏を終えて現われたトスカを揺さぶるため、隣室でカヴァラドッシを拷問する。恋人の悲痛な叫びに、トスカはついに隠れ家の場所を吐いてしまう。カヴァラドッシは、トスカの裏切りに怒りをにじませるが、その時、先ほどの戦報は誤りで、実はナポレオン軍が勝ったとの知らせ。勝利だ！　と叫ぶカヴァラドッシ。スカルピアは直ちに投獄を命じる。連行されるカヴァラドッシを追うトスカを止めて、スカルピアはトスカを口説く。恋人の助命と引き換えに身体を要求するスカルピアに、トスカは侮蔑を投げつけるが、あと1時間で処刑と脅されては、承諾するしかない。スカルピアは見せかけの銃殺刑を部下に命じる。さらにトスカは逃げるための旅券も所望する。スカルピアがそれを書く間に、トスカは食卓のナイフを後ろ手に隠し、自分を抱こうとするスカルピアを刺殺する。

　暁の鐘、牧童の歌声。獄に繋がれたカヴァラドッシが、トスカとの幸せな愛の日々を思い出していると、自由の身になったことをトスカが告げに来る。そして、スカルピアを殺した、と。二人は国を出られることの喜びを分かち合う。その前に見せかけの銃殺刑をやらねばならない。夜明けを告げる鐘が鳴り、処刑の時刻が迫る。芝居がうまくいくか、トスカは気が気でない。銃声がして、カヴァラドッシが倒れ込み、兵士たちが去ったのを見届けて、トスカはカヴァラドッシに駆け寄るが、彼は死んでいた！　スカルピアに騙されたのだ。慟哭するトスカ。やがてスカルピアの殺害に気づいた部下たちが、犯人を捕えようとやってくるが、トスカは城壁から身を投げて、幕となる。